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巢式PCR實驗方法

提供者:上海雅吉生物科技有限公司   發布時間:2019/3/18  閱讀次數:21次   進入該公司展臺

 實驗方法原理
由于巢式PCR反應有兩次PCR擴增,從而降低了擴增多個靶位點的可能性(因為與兩套引物都互補的引物很少)增加了檢測的敏感性;又有兩對PCR引物與檢測模板的配對,增加了檢測的可靠性。 由于第二套引物位于第一輪PCR產物內部,而非目的片斷包含兩套引物結合位點的可能性極小,因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。
 
 
巢式PCR反應模式圖
實驗材料基因樣品
試劑、試劑盒PCR緩沖液Tris·HClKClTaq聚合酶
儀器、耗材PCR儀
實驗步驟
1.  目標的DNA模板藍色的第一對引物結合。第一對引物也可能結合到其他具有相似結合位點的片段上并擴增多種產物。但只有一種產物是目的片斷(圖中未顯示可能的多種產物)。
 
2.  使用圖中紅色標記的第二套引物對第一輪PCR擴增的產物進行第二輪PCR擴增。
 
第一輪
 
1.  大小:1192 bp
 
2.  初始孵育:94℃4分鐘
 
3.  變性:94℃45秒
 
4.  退火:58℃45秒
 
5.  聚合:72℃45秒
 
6.  PCR循環:36
 
第二輪
 
1.  大小:271 bp
 
2.  初始溫育:95℃2分鐘
 
3.  變性:95℃45秒
 
4.  退火:60℃下45秒
 
5.  聚合:72℃30秒
 
6.  PCR循環:36
收起 
注意事項
1.  引物設計原則:每個特異性引物為24~26個堿基,Tm:64-65%,GC:44-55% 。這樣你可以同時做多個不同的TAIL PCR。
 
2.  在第一輪PCR結束之后,將PCR產物稀釋1 000倍(視情況而定)作為第二輪PCR的模板,第二輪PCR的產物同樣稀釋1 000倍(視情況而定)作為第三輪PCR的模板,這樣依次類推。實際操作中可以搞3輪甚至更多,當然做3輪是比較合適了,這個時候PCR的產物已經是高度特異性了。
其他
1.  圖解
 

關鍵詞:巢式PCR  

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